Genomics phân tích và tịnh tiến

Đây là những hướng dẫn dành cho các nhà nghiên cứu đang dự tính sử dụng các dịch vụ Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) từ Tài nguyên được chia sẻ ATG. Tất cả các nhà nghiên cứu được khuyến khích tham khảo ý kiến ​​của nhân viên ATG trước khi bắt đầu chuẩn bị hoặc phân tích mẫu. Chúng tôi có thể hỗ trợ thiết kế thử nghiệm và nếu cần thiết, bạn có thể liên hệ với các nhà thống kê sinh học chuyên nghiệp, những người có thể giúp thiết kế thử nghiệm. Điều rất quan trọng là phải xem xét thiết kế thí nghiệm trước khi bắt đầu các thí nghiệm NGS, điều này có thể khá tốn kém.

RNA-seq có thể được thực hiện thành công với một lượng rất nhỏ RNA. Tuy nhiên, số lượng cần thiết phụ thuộc vào "độ sâu đọc" cần thiết và liệu có bị nhiễm RNA ribosome hay không. RNA ribosome là 90% RNA trong tế bào, vì vậy cần phải loại bỏ hoặc giảm bớt RNA ribosome trước khi thực hiện RNA-seq. Hai cách để làm điều này là loại bỏ vật lý, thông qua "Ribodepletion", trong đó các đầu dò được đánh dấu biotin bổ sung cho các RNA ribosome được lai với các mẫu RNA, sau đó các phức hợp được bắt giữ và loại bỏ. Ngoài ra, có thể sử dụng phương pháp chuẩn bị thư viện hướng poly (ví dụ: Smart-Seq) để tránh sắp xếp trình tự RNA ribosome, nhưng loại trừ các RNA khác thiếu đuôi polyA và có thể được quan tâm (ví dụ: microRNA). Vui lòng liên hệ với nhân viên Tài nguyên được Chia sẻ của ATG để thảo luận về các lựa chọn trước khi bắt đầu thử nghiệm.

ATG Shared Resource thực hiện phân tích NGS đầy đủ dịch vụ. Tuy nhiên, do sự phức tạp của việc chuẩn bị thư viện NGS, những gì ATG có thể cung cấp phụ thuộc vào loại thử nghiệm. Đối với giải trình tự bảng điều khiển được nhắm mục tiêu và giải trình tự exome, chúng tôi chỉ cần mẫu DNA và chúng tôi sẽ tạo ra các thư viện, thực hiện giải trình tự và phân tích ban đầu. Chúng tôi sẽ cung cấp một báo giá cho chi phí dự kiến ​​trước khi bắt đầu công việc. Đối với RNA-seq và các phương pháp tiếp cận khác, có nhiều biến thể trong cách thức xây dựng thư viện. Chúng tôi khuyến khích người dùng liên hệ với nhân viên ATG để thảo luận về các lựa chọn trước khi bắt đầu. Bên cạnh hệ thống Affymetrix hoàn chỉnh, ATG Shared Resource còn có máy đo phổ Nanodrop để định lượng RNA với khối lượng nhỏ và máy phân tích sinh học Agilent để phân tích nhanh chất lượng và số lượng của mẫu RNA hoặc DNA.

Các thí nghiệm NGS có thể tốn kém. Tổng chi phí cho hầu hết các thí nghiệm lớn (giải trình tự exome, RNA-seq, v.v.) là $ 500 đến $ 800 cho mỗi mẫu, cộng với phí tin sinh học. Một số thử nghiệm giải trình tự được nhắm mục tiêu nhỏ hơn có giá thấp hơn cho mỗi mẫu. Vui lòng liên hệ với nhân viên để biết thêm thông tin và nhận báo giá.

Đúng! Các thí nghiệm NGS tạo ra các tập dữ liệu lớn, phức tạp. Không thể phân tích tin sinh học nếu không có bản sao. Bộ ba là tốt hơn. Nhân rộng thực sự là cần thiết để có được kết quả tốt, có ý nghĩa và đáng giá.

ATG Shared Resource tuân theo các hướng dẫn kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt và các quy trình vận hành tiêu chuẩn để đảm bảo rằng dữ liệu có chất lượng cao nhất và đáp ứng hoặc vượt quá các tiêu chuẩn do các nhóm như tổ chức ENCODE đặt ra. Chúng tôi sử dụng các biện pháp kiểm soát tăng đột biến tiêu chuẩn để giám sát các quy trình nội bộ và thực hiện kiểm tra kiểm soát chất lượng ở mọi giai đoạn sản xuất và trình tự thư viện. Vui lòng liên hệ với nhân viên ATG để xem các ví dụ về dữ liệu mà chúng tôi đã tạo thành công.

Chất lượng của các mẫu RNA ban đầu sẽ được xác nhận bằng cách sử dụng Máy phân tích sinh học Agilent hoặc bằng cách sử dụng PCR thời gian thực. Các thư viện sẽ được kiểm tra tương tự trước khi giải trình tự. Kiểm soát tăng tốc được thêm vào ở một số bước để giám sát kiểm soát chất lượng nội bộ.

Các thử nghiệm NGS tạo ra các tập dữ liệu lớn, phức tạp chứa lượng thông tin khổng lồ, nhưng cũng có thể khó phân tích. Tài nguyên được chia sẻ ATG cung cấp cấp độ phân tích đầu tiên, bao gồm phân tích các thông số kiểm soát chất lượng, căn chỉnh các lần đọc với bộ gen thích hợp, xác định các biến thể trình tự hoặc số lượng tính năng, nếu thích hợp và thực hiện các loại diễn giải đơn giản, chẳng hạn như sản xuất bản đồ nhiệt cho RNA-seq. Tuy nhiên, các loại phân tích dữ liệu phức tạp hơn, chẳng hạn như kết quả tương quan với thông tin bệnh nhân, nên được thực hiện với đầu vào của các chuyên gia từ Nguồn tin sinh học được chia sẻ hoặc Nguồn lực được chia sẻ thống kê sinh học. Nhân viên ATG có thể giúp thiết lập các tương tác với các chuyên gia thích hợp, những người nên tham gia ngay từ đầu để giúp thiết kế thử nghiệm và kiểm soát chất lượng.

Có khả năng quá trình phức tạp liên quan đến việc tạo dữ liệu NGS sẽ tạo ra "hiệu ứng ngày" hoặc "hiệu ứng hàng loạt", trong đó các mẫu được xử lý hoặc phân tích trên cùng một cụm dữ liệu với nhau. Đây là một tạo tác nổi tiếng về phân tích dữ liệu chiều cao và chúng tôi bao gồm các biện pháp kiểm soát tăng đột biến để giúp chúng tôi xác định và loại bỏ các loại vấn đề dữ liệu này.

ATG Shared Resource có một nhóm các chuyên gia tin sinh học, những người sẽ thực hiện phân tích dữ liệu ban đầu và những người sẽ quản lý và sao lưu dữ liệu. Họ có thể thực hiện hầu hết các loại phân tích đơn giản (ví dụ: biểu hiện gen từ RNA-seq). Tuy nhiên, các loại phân tích phức tạp hoặc tùy chỉnh sẽ yêu cầu đầu vào của các chuyên gia bổ sung từ Tài nguyên được chia sẻ thống kê sinh học hoặc tin sinh học. Nhân viên ATG có thể giúp thiết lập các hợp tác cần thiết.

Xác minh là một phần quan trọng của mỗi thử nghiệm NGS và các yêu cầu khác nhau tùy thuộc vào loại thử nghiệm. Vui lòng liên hệ với nhân viên ATG để thảo luận về các lựa chọn xác minh kết quả NGS.

Giám đốc cơ sở, Tiến sĩ Scott A. Ness., có thể cung cấp thư hỗ trợ và lời khuyên về cách mô tả Tài nguyên được chia sẻ ATG và các thử nghiệm NGS tiềm năng trong các ứng dụng tài trợ. Tiến sĩ Ness đã phục vụ trong nhiều phần nghiên cứu NIH, ACS và DOD và đã xem xét nhiều đơn xin tài trợ bao gồm các thí nghiệm NGS. Các khoản tài trợ do chính ông tài trợ có các thử nghiệm NGS trong đó. Anh ấy có thể cung cấp trợ giúp về việc viết các phần tài trợ của bạn liên quan đến các thử nghiệm NGS và có thể chỉ ra những cạm bẫy tiềm ẩn và những điều cần tránh.

Cách dễ nhất để chỉ trích một thử nghiệm NGS là mô tả nó như một cuộc thám hiểm câu cá. Dưới đây là một số điều bạn chắc chắn nên tránh.

1. Không đề xuất mô tả đặc điểm của các gen mà bạn chưa xác định được. Nếu bạn không có dữ liệu sơ bộ, bạn không biết bạn sẽ tìm thấy những gen nào hoặc bao nhiêu gen. Tuy nhiên, chúng có thể sẽ lên đến hàng trăm. Nói đơn giản rằng bạn sẽ chọn một số gen thú vị để nghiên cứu là một cách nhanh chóng để bạn bị điểm kém trong khoản trợ cấp của mình. Nếu có thể, thử nghiệm của bạn nên kiểm tra một giả thuyết. Ví dụ, bạn có thể đưa ra giả thuyết rằng một số gen nhất định (ví dụ như gen apoptosis) sẽ được cảm ứng. Sau đó, bạn có thể đề xuất sử dụng các xét nghiệm NGS để kiểm tra điều đó (và đề xuất PCR thời gian thực như một phương pháp dự phòng). Bằng cách đó, bạn có thể kiểm tra giả thuyết, đề xuất các kết quả và kiểm soát dự kiến ​​(ví dụ: gen nên tăng và giảm), đây là một cách tốt hơn nhiều để thực hiện một thí nghiệm NGS (hoặc bất kỳ thí nghiệm nào khác). Đơn giản là đi câu cá để tìm gen là một cách tiếp cận tồi và luôn thu hút sự phẫn nộ của hội đồng đánh giá.
2. Nói đơn giản rằng bạn sẽ sử dụng một số chương trình phần mềm để phân tích dữ liệu hoặc nhóm các gen thành các con đường cũng sẽ khiến bạn gặp rắc rối. Dữ liệu NGS có thể cực kỳ phức tạp và sẽ yêu cầu các phương pháp thống kê để phân tích. Dữ liệu đường dẫn đã biết là không đầy đủ. Dù sao đi nữa, hầu hết các gen đều không nằm trong các con đường, bạn sẽ cần một cách tiếp cận có kế hoạch tốt để phân tích dữ liệu. Bạn nên có một cách để biết liệu thí nghiệm có hoạt động hay không (ví dụ: các gen apoptosis mong đợi đã được kích hoạt chưa?).
3. Thử nghiệm NGS không nên chỉ là một đoạn văn ở cuối một trong những mục tiêu của bạn. Dù bạn làm gì, tuyệt đối không thêm thử nghiệm NGS vào cuối đơn xin tài trợ như một việc mà bạn "cũng sẽ làm". Các thí nghiệm NGS rất lớn, tốn kém và phức tạp và chúng không thể được thực hiện như một suy nghĩ sau. Nhiều, rất nhiều khoản tài trợ có mô tả một đoạn về thí nghiệm NGS mà các nhà nghiên cứu cũng sẽ thực hiện. Đó là một cột thu lôi cho những lời chỉ trích từ các nhà phê bình.
4. Nếu bạn đang tìm kiếm gen, bạn nên tìm kiếm chúng vì một lý do. Đừng chỉ đề xuất tìm kiếm các gen được điều chỉnh mà không đề xuất làm điều gì đó với chúng. Tìm kiếm các gen di chuyển lên và xuống không phải là một mục tiêu đủ quan trọng. Bạn cần phải tìm kiếm các gen với mục đích nào đó trong đầu (ví dụ: một số giả thuyết cần được kiểm tra).